掃描電子偏光顯微鏡樣品的制備及關(guān)注
發(fā)布人：shpuda發(fā)布時(shí)間：2014/4/23
掃描電子偏光顯微鏡觀察時(shí)要求樣品必須干燥，并且表面能夠?qū)щ?。因此，在進(jìn)行掃描電鏡生物樣品制備時(shí)一般都需采用固定、脫水、干澡及表面被金等處理步驟。
1.固定及脫水
生物樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)易遭破壞，因此在進(jìn)行制樣處理和進(jìn)行電鏡觀察前必須進(jìn)行固定，以使其能最大限度地保持其生活時(shí)的形態(tài)。而采用水溶性、低表面張力的有機(jī)溶液如乙醉等對(duì)樣品進(jìn)行梯度脫水，也是為了在對(duì)樣品進(jìn)行干操處理時(shí)盡最減少由表面張力引起的其自然形態(tài)的變化。
將處理好的、干凈的蓋玻片.切割成4-6 mm2的小塊，將待檢而較濃的大腸桿菌懸浮液滴加其上，或?qū)⒕χ苯油可希部捎蒙w玻片小塊黏貼于菌落表面，自然干澡后光學(xué)偏光顯微鏡下鏡檢，以菌體較密，但又不堆在一起為宜。標(biāo)記蓋玻片小塊有樣品的一面;將上述樣品置于1% -2%戊二旺磷酸緩沖液(pH7.2左右)中，于4℃冰箱中固定過(guò)夜。每次用15%的同一緩沖溶液沖洗，用40%,70%,90%和100%的乙醉分別依次脫水，每次15min，脫水后，用醋酸戊醋置換乙醇。
另一種與之類似的樣品制備方法是采用離心洗滌的手段將菌體依次固定及脫水，最后涂布到玻片上。其優(yōu)點(diǎn)是:①在固定及脫水過(guò)程中可完全避免故體與空氣接觸，從而可最大程度地減少因自然干燥而引起的菌體變形。②可保證最后制成的樣品中有足夠的菌體濃度，因?yàn)橥吭诓Ｆ系木w在固定及干燥過(guò)程中有時(shí)會(huì)從玻片上脫落。③確保玻片上有樣品的一面不會(huì)弄錯(cuò)。
2.干燥
將上述制備的樣品置于臨界點(diǎn)干燥儀中，浸泡于液態(tài)二氧化碳中，加熱到臨界點(diǎn)溫度(31.4℃,7 376.46 kPa,即72.8個(gè)大氣壓)以上，使之氣化進(jìn)行干澡。
樣品經(jīng)脫水后，有機(jī)溶劑排擠了水分，浸占了原來(lái)水的位置。水是脫掉了，但樣品還是浸潤(rùn)在溶劑中，還必須在表面張力盡可能小的情況下將這些溶刑“請(qǐng)”出去，使樣品真正得到干燥。目前采用最多、效果最好的方法是臨界點(diǎn)干燥法。其原理是在一裝有溶液的密閉容器中，隨著m度的升高，蒸發(fā)迅速加快，氣相密度增加，液相密度下降。當(dāng)赴度增加到某一定值時(shí)，氣、液二相密度相等，界面消失，表面張力也就不存在了。此時(shí)的沮度及壓力即稱為臨界點(diǎn)。將生物樣品用臨界點(diǎn)較低的物質(zhì)且換出內(nèi)部的脫水荊進(jìn)行干燥，可以完全消除表面張力對(duì)樣品結(jié)構(gòu)的破壞。目前用得最多的置換荊是二飯化碳。由于二級(jí)化碳與乙醇的互溶性不好，因此樣品經(jīng)乙醉分級(jí)脫水后還需用與這兩種物質(zhì)都能互溶的“媒介液一險(xiǎn)酸戊陳炭換乙醉。
3.噴鍍及觀察
將樣品放在真空鍍腆機(jī)內(nèi)，把金噴鍍到樣品表面后，取出樣品在掃描電鏡中進(jìn)行觀察。
試驗(yàn)報(bào)告
1:結(jié)果
繪圖描述你所制備的大腸桿菌和pBR322質(zhì)粒DNA電鏡制片在電子偏光顯微鏡下觀察到的形態(tài)特點(diǎn)。
2.思考題
(1)利用掃描電子顯微鏡來(lái)觀察的樣品為什么要放在以金屬網(wǎng)作為支架的火棉膠膜(或其他膜)上，而掃描電子顯微鏡則可以將樣品固定在蓋玻片上觀察?
(2)用負(fù)染法制片時(shí)，磷鎢酸鈉或礴鎢酸鉀起什么作用?
(3)你還知道哪些電子偏光顯微鏡樣品制備技術(shù)?你認(rèn)為可以用透射電鏡觀察樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)而用掃描電鏡觀察樣品表面結(jié)構(gòu)嗎?
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